Открытие пенициллина

Субстраты и условия ферментации: от лабораторной чашки к промышленному биореактору

Первичное выделение пенициллина Александром Флемингом в 1928 году базировалось на глубинном культивировании Penicillium notatum на мясо-пептонном бульоне. Однако выход активного вещества составлял менее 2 единиц на миллилитр (Ед/мл) — катастрофически низкий показатель для клинического применения. Ключевой технической проблемой являлась нестабильность бета-лактамного кольца при pH выше 7,0 и температуре свыше 37 °C.

Прорыв в Оксфорде (группа Чейна — Флори, 1940) потребовал замены штамма на Penicillium chrysogenum (изолят из плесени с дыни). Оптимизация состава среды для глубинного выращивания включала:

• Источник углерода: лактоза (40–60 г/л) вместо глюкозы — для замедленного потребления и предотвращения катаболитной репрессии.
• Источник азота: кукурузный экстракт (corn steep liquor) — дешевый побочный продукт крахмалопаточного производства, обогащенный аминокислотами и минералами (Zn, Cu, Fe).
• Буфер: фосфатный буфер (0.1–0.2 M), поддерживающий pH в узком диапазоне 6.5–6.8.

Аэрация осуществлялась барботированием стерильного воздуха (0.5–1.0 vvm) через стеклянные фильтры или перфорированные трубки из нержавеющей стали AISI 304. Выход пенициллина после 7–10 суток ферментации достигал 150–200 Ед/мл.

Химические отличия от сульфаниламидов и спецификация бензилпенициллина

Сульфаниламиды (пронтозил, стрептоцид), доминировавшие в терапии до 1942 года, действовали как антиметаболиты парааминобензойной кислоты, конкурентно ингибируя синтез фолиевой кислоты у бактерий. Пенициллин же специфично связывался с пенициллин-связывающими белками (PBP) клеточной стенки, блокируя реакцию транспептидации — финальную стадию сборки пептидогликана. Это обуславливало избирательную токсичность: у млекопитающих клеточная стенка отсутствует.

Молекулярная формула бензилпенициллина (пенициллин G) — C₁₆H₁₈N₂O₄S. Молярная масса: 334.39 г/моль. Кристаллическая структура: моноклинная сингония, пространственная группа P2₁. Ключевые физико-химические показатели для фармакопеи (USP 1944):

• Активность (биологическая): не менее 1650 Ед/мг в пересчете на сухое вещество.
• Растворимость: 0.25 г/100 мл воды (25 °C), резко возрастает в буферных растворах с pH 6.0–7.0.
• Температура плавления калиевой соли: 214–216 °C (с разложением).
• УФ-спектр: λmax 262 нм (ε 1200) в водном растворе.

Методы очистки: лиофилизация, распределительная хроматография и кристаллизация

Первоначально Флеминг использовал фильтрацию через бактериальные фильтры Зейтца (асбестовые диски) и подкисление до pH 2.0 с последующей экстракцией диэтиловым эфиром. Однако эфир легко воспламенялся и дезактивировал пенициллин. В 1941 году Чейн применил метод обращенно-фазового распределения: центрифужная экстракция амилацетатом при pH 2.5 с последующей реэкстракцией в фосфатный буфер pH 6.8.

Промышленная технология (Merck & Co., 1943) включала несколько стадий:

• Глубинная фильтрация культуральной жидкости через пластины с диатомитом (Celite 545) для удаления мицелия.
• Экстракция жидким амилацетатом в противоточном экстракторе (Podbielniak) — степень извлечения до 85%.
• Обесцвечивание активированным углем (Norit) в количестве 5–10% от объема.
• Лиофильная сушка — удаление воды при -45 °C и давлении 100 мкм рт. ст. для сохранения активности.

Чистота продукта оценивалась специфическим биологическим методом — разведение в мясо-пептонном агаре с Staphylococcus aureus. К концу 1944 года на заводе в Терре-Хот (Индиана) выпускали 100 тонн кристаллического натриевого пенициллина в месяц с активностью 1650 Ед/мг — стандарт, сохранившийся до 1950-х.

Штаммовые улучшения и контроль качества в 1944–1945 годах

Радиационный мутагенез (Рентгеновское излучение 50 кВт, доза 1000–2000 рад) штамма P. chrysogenum NRRL 1951 в лаборатории USDA (Пеория) дал мутант NRRL 1951.B25, синтезирующий до 850 Ед/мл. Требования к полупродукту и финальной соли были жестко регламентированы:

• Пирогенность: тест на кроликах — прирост температуры не более 0.6 °C за 3 часа после внутривенного введения.
• Токсичность: внутрибрюшинное введение мышам (0.5 мл 1% раствора) — отсутствие падежа в течение 48 часов.
• Стерильность: посев на тиогликолевую среду (37 °C, 14 суток) и среду Сабуро (22 °C, 14 суток).

Отказ от использования целлофановых мембран для диализа (из-за низкой скорости диффузии) в пользу непрерывной экстракции с вращающимся дисковым контактором (с разработка фирмы «Сиба», 1944) повысил степень чистоты до 98.5%.

Добавлено: 08.05.2026